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以下是关于DMD/BMD基因治疗和临床试验方面的最新进展,希望能让患者和家属客观了解目前阶段基因治疗发展到什么水平,主要的基因治疗策略优缺点如何,今后发展的方向在哪里。愿这篇文章能给大家带去一些希望和慰藉。

-肌萎缩侧索硬化症(LGMD2C)是最常见的肢带肌病之一。它影响每1,000,000人不到10人,其特征是骨盆(骨盆带)和肩膀(肩胛带)的进行性肌无力,与编码-肌糖蛋白的SGCG基因突变有关。目前尚无治愈这种神经肌肉疾病的方法。

主要的基因治疗方向有四种:

在这项研究中,Isabelle
Richard的团队:证明了全身基因疗法治疗的概念:表达缺乏的-肌聚糖的AAV8药物载体允许蛋白质在注射后的小鼠模型中在受治疗的肌肉中重新表达,

一、病毒导入剪裁后的Dystrophin基因。概括来说,就是利用不直接引起人类疾病,免疫原性较小的腺相关病毒(Adeno-Associated
Virus,AAV)为载体,导入人工剪裁的,去除大部分杆状区序列和羧基端序列的minidystrophin基因。AAV具有多达上百种血清型,广泛用于多种疾病的基因治疗,针对肌营养不良,选用对肌肉细胞有亲和性的血清型(AAV-1,AAV-2等)经过基因工程重组后作为载体,转载入约4Kb
minidystrophin序列。在mdx小鼠(公认的DMD动物模型)中取得良好治疗效果后[15],在美国进行了I期临床试验,共对6名DMD患儿行一侧肢体超声引导下肌内注射,观察24个月,主要验证安全性,结果未发现严重不良反应。[16]这一基因治疗方法的优点在于,无论DMD基因缺陷为何种类型,均可通过导入外源替代基因恢复或部分恢复功能。主要缺点则包括,1、病毒载体存在一定风险,如自身复制、免疫激活、插入染色体致突变、致癌等,如需通过循环系统全身注射,需要相当大的病毒载量,风险更高;2、病毒载体导入基因表达不稳定,并随时间快速递减,不能持续稳定表达;3、AAV病毒载量有限,无法携带完整Dystrophin
mRNA,经剪裁的minidystrophin虽可替代大部分功能,但仍会遗留轻的临床症状。北京协和医院神经科戴毅

确定有效治疗剂量:测试三种不同剂量。药物载体以最高剂量恢复,几乎完全表达缺陷型SGCG基因。研究人员观察到,最低剂量校正肌纤维的比例小于5%,中间剂量为25%至75%,最高剂量为75%至100%(见图)

二、外显子跳跃(Exon
Skipping)。正是由于包含24个重复序列的杆状区去除部分仍可保存大部分蛋白功能,而在前mRNA剪切过程中,可利用反义寡核苷酸链跳过相应外显子区域,使由缺失打乱的读码框恢复正常,获得裁短的部分dystrophin蛋白,承担大部分功能。导致DMD最常见的突变是外显子45至52之间的缺失突变[17],而外显子51的起始部分三核苷酸密码子并不完整,需要与外显子50最后部分相组合,因此保留外显子51而其前方外显子缺失会导致读码框移位,而外显子52的起始部分则为完整密码子。利用反义寡核苷酸链跳过外显子51的外显子,就可恢复读码框。针对外显子51跳跃已有两种生物制剂PRO051和AVI-4658进入临床试验阶段。PRO051临床试验在荷兰完成,共对4名基因突变类型适合外显子51跳跃治疗的DMD患者进行胫前肌局部注射PRO051治疗。28天后肌肉活检发现跳过外显子51的部分Dystrophin在所有病人均有表达,dystrophin免疫荧光染色阳性肌纤维所占比例达到64%-97%,而患者此前数年的肌肉活检几乎未见dystrophin免疫荧光染色纤维,所治疗肌肉的dystrophin含量约占正常肌肉的17%-35%,整个治疗过程中无明显不良反应。[18]AVI-4658临床试验在英国完成,7名适合外显子51跳跃治疗的患者进行了一侧趾短伸肌(Extensor
Digitorum
Brevis)局部注射治疗,对侧趾短伸肌注射生理盐水对照,3-4周后行肌活检,治疗侧肌肉dystrophin蛋白含量约占正常人的26.4%,对照侧则为17%,结果具有统计学意义,治疗过程中安全性良好。[19]该方法的优点是无需特殊载体与辅助用药,直接注射生物制剂;致癌、免疫激活等副作用相对少,安全性良好。主要缺点是1、只能针对特定基因缺陷类型治疗,对病人选择严格;2、寡核苷酸链进入细胞膜能力有限,效率较低,特别是全身治疗,如何更好地进入目标组织等问题仍有待解决;3、寡核苷酸链仍可能有免疫原性。

此外,研究人员还观察了体育锻炼对肌肉纤维的影响,并发现在最高剂量下,治疗可使经过处理的肌肉纤维抵抗压力。

三、
克服无义突变,跳过异常中止子。约5%-15%DMD患者的分子发病机制是DMD基因发生无义突变,产生错误终止子,从而导致蛋白翻译提前终止,生成不完整,无功能的Dystrophin。Sweeney教授的研究小组发现氨基甙类抗生素――庆大霉素能够在Dystrophin翻译过程中降低核糖体识别出非正常终止子(Premature
Termination
Codons,PTCs)的能力,从而跳过这些异常终止子,继续翻译。更为重要的是,这一结果不仅在体外实验中被证实,还在mdx小鼠(外显子23包含无义突变)动物模型中取得明显疗效,发现了重新生成的具备功能的Dystrophin出现在横纹肌细胞膜下。这也是第一次证实化学药物能够在遗传性疾病动物模型中取得疗效[20]。以此为基础,在对DMD患者的临床试验中,基因缺陷类型属于无义突变的患者也取得了相似的结果,证实在人体同样有效。[21]但庆大霉素的应用也存在局限性。一方面,庆大霉素跳过无义突变的效能较低;另一方面,长期大量应用庆大霉素存在较大的毒副作用。所以科研人员对多达800,000化合物进行了筛选,以期选择出一种效能更强,副作用更小的治疗药物,最终选择出一种名为PTC124的有机化合物(3-[5-(2-fluorophenyl)-[1,2,4]oxadiazol-3-yl]-benzoic
acid;
C15H9FN2O3)。在DMD患者肌细胞和mdx小鼠肌细胞体外实验中,PTC124可将dystrophin的表达水平分别抬高至正常对照的40%-60%和35%的水平,而对mdx小鼠药物治疗2-8周后,肌肉切片病理显示dystrophin的表达水平约为野生型小鼠的20%-25%,已基本达到公认的恢复肌肉功能所需的表达水平。这与动物实验中治疗组小鼠对收缩动作耐受性增强及肌酶下降的结果相吻合。[22]在人体临床试验方面,在健康志愿者中,口服PTC124吸收良好,无明显不良反应。[30,31]
在DMD患者中进行的IIa期临床试验已经完成,共对38名5-17岁患儿分为高、中、低三个剂量组,给予28天口服PTC124治疗,无明显不良反应,部分病人在复查的肌肉活检标本中见到Dystrophin表达增多,肌酶明显下降,但未观察到肌肉力量变化。[32]此外,在另一种常见常染色体隐性遗传疾病――囊性纤维化(Cystic
Fibrosis,约10%因无义突变所致)中也已完成I期、II期临床试验,证明PTC124口服吸收好,无明显不良反应,耐受性良好,并可在人体发挥生物学效应。[23]这一治疗的优点在于化学药物,口服给药,治疗方便。缺点则是1、需严格选择特殊突变类型的病人;2、药物可能的短期或长期副作用。

这项研究是几年工作的结果。事实上,我们已经测试了另一种被证实耐受良好但基因表达有限的载体。由于这项工作,我们确定了对患者有效的载体和剂量。今天我们有办法进行临床试验,这项工作的第一作者伊莎贝尔理查德兴奋不已。

以上三种旨在恢复外源或内源Dystrophin蛋白表达的基因治疗方法面临着一个共同的问题就是患者自身的免疫监控对新生成的Dystrophin蛋白可能产生特异性抗体,从而引发自身免疫反应,造成免疫攻击。这一点已在部分临床试验受试者中被证实。[21]

2006年,由Genethon领导的第一阶段I基因治疗临床试验测试了9名患者肌内注射AAV1载体的功效。注射后一个月,研究人员发现该产品具有良好的耐受性,并且治疗基因存在于以最高剂量但数量有限的患者中进行治疗(结果发表于Brain,2012年1月11日)。

四、上调代偿蛋白。与Dystrophin高度同源,同样能与肌动蛋白和跨膜糖蛋白(β-dystroglycan)相连接的常染色体编码蛋白Utrophin
A,在胚胎期广泛存在于骨骼肌细胞膜下,起到与Dystrophin类似的连接细胞内骨架和细胞外基质的功能。出生后Utrophin
A在骨骼肌中的表达减少,仅在神经肌肉接头处突触后膜有所保留(对突触形成及乙酰胆碱受体的聚集定位发挥重要生理作用[24]),转而由Dystrophin稳定肌细胞膜。在某些特定情况下,如Dystrophin缺陷患者中,Utrophin
A会出现一定程度的上调,并重新分布于突触以外的肌细胞膜下,部分代偿Dystrophin的功能。[25]尽管这种自身代偿性上调远远不足以改善临床症状,却提供了一条治疗Dystrophin缺陷性疾病的新策略――即通过药物或生物制剂上调Utrophin,代偿Dystrophin的功能。Tinsley等首先在mdx小鼠动物模型上证明,
Utrophin可代偿Dystrohpin的功能,明显延缓肌营养不良病程的进展。[27,28]上调的具体手段多种多样:直接导入完整或经剪裁的Utrophin[34];病毒载体导入经剪裁的Utrophin[33];激活Utrophin的转录[29,35,36];在转录后稳定其mRNA,增加蛋白翻译等[26]。其中筛选出的一些小分子已开始进入临床试验阶段。英国VASTox公司用于上调utrophin的小分子药物VOX
C1100在2007年就取得欧洲药监局的孤药认证,并准备在2008年进入临床试验阶段,但并未真正实施。2010年美国BioMarin公司的BMN195开始健康志愿者的I期临床试验,但试验结果显示药物口服吸收不理想,无法达到治疗所需药物浓度,从而终止了进一步试验。虽然初期临床试验结果不理想,但上调Utrophin仍是治疗DMD/BMD的一条重要途径,筛选合适药物成为关键。与前三种基因治疗方法比较,这一治疗策略的优势在于:1、利用体内已存在的蛋白,避免了针对新蛋白的免疫反应。2、可通过多个步骤、多种途径,达到上调Utrophin的目的。主要缺点是:1、utrophin蛋白虽与dystrophin蛋白高度同源,但毕竟不是相同蛋白,可能在一些生物学特性上仍有差异,是否能代偿dystrophin的全部功能,尚存疑问;2、utrophin本身的生物学功能尚未完全明了,过度上调utrophin可能带来一些无法预测的不良生物学效应。

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